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小鼠基因型鑒定詳解，必看！
問(wèn)題一：
Q：鼠達(dá)人，實(shí)驗(yàn)室新引進(jìn)新的基因工程小鼠，如何鑒定小鼠的基因型呢？
A：常用的小鼠基因型鑒定方法有：常規(guī)PCR鑒定，qPCR鑒定以及測(cè)序鑒定，每種鑒定方法都有各自的特點(diǎn)。
01 | 常規(guī)PCR鑒定
常規(guī)PCR是目前最常用的基因型鑒定方法。通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)基因片段（可借助Primer-BLAST等軟件設(shè)計(jì)并校驗(yàn)引物特異性），然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的條帶大小差異來(lái)判斷小鼠的基因型。
優(yōu)勢(shì)：操作簡(jiǎn)便、成本較低，適用于已知突變位點(diǎn)的基因分型，常見(jiàn)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。
局限性：無(wú)法檢測(cè)未知變異，靈敏度較低。
02 | qPCR鑒定
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR, qPCR）是一種更為精準(zhǔn)的基因型鑒定方法。它通過(guò)熒光信號(hào)（如SYBR Green或TaqMan探針）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程，不僅可以判斷基因型，還能夠通過(guò)熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)基因拷貝數(shù)的定量分析。
優(yōu)勢(shì)：靈敏度高、特異性強(qiáng)，支持定量分析。
局限性：依賴(lài)探針或優(yōu)化條件，設(shè)備成本高，操作復(fù)雜度高于常規(guī)PCR。
03 | 測(cè)序鑒定
在特定研究場(chǎng)景中，測(cè)序鑒定（如Sanger測(cè)序或NGS）是必不可少的手段，如點(diǎn)突變模型小鼠的基因型驗(yàn)證，或基因編輯產(chǎn)生的微小缺失/插入突變（僅涉及數(shù)個(gè)堿基）。通過(guò)測(cè)序可以直接讀取目標(biāo)基因的堿基序列，從而精準(zhǔn)判定基因型。
優(yōu)勢(shì)：結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，可發(fā)現(xiàn)新突變。
局限性：成本高、數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。
問(wèn)題二：
Q：鼠達(dá)人，最常用的是常規(guī)PCR鑒定，那具體怎么操作呢？
A：已經(jīng)準(zhǔn)備好了，看這里。
01 | 樣本準(zhǔn)備
在基因型鑒定中，小鼠基因組DNA的制備是決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的關(guān)鍵。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，通常在小鼠斷奶前后（約3周齡）采集組織用于基因組DNA提取，例如剪取尾尖或耳組織。
不建議在較大齡時(shí)剪趾取樣，如果必須通過(guò)剪趾獲取組織，應(yīng)在小鼠出生后10–15天內(nèi)完成，以同時(shí)起到標(biāo)記編號(hào)作用。
注意：
① 鼠尾尾尖(2~3mm)，鼠耳約2~5mm2，腳趾1枚可獲得的DNA量足夠用于基因型鑒定。
② 剪組織的剪刀每剪完一次需用酒精棉擦拭，避免DNA交叉污染。
③ 避免組織樣本帶有血液（血液中的溶血產(chǎn)物或抑制劑可能干擾PCR擴(kuò)增）。
④ 采樣后若不立即進(jìn)行樣品消化，需保存于-20℃或更低溫度，在消化前避免反復(fù)凍融。
02 | DNA提取
1) 將組織（鼠尾）剪碎置于離心管中，加入47 μL裂解液和3μL蛋白酶K(20 mg/mL)。
2) 充分振蕩混勻且完全浸沒(méi)樣本后，離心管置于55℃烘箱孵育過(guò)夜（確保組織完全消化）。
3) 消化完成的樣本，于PCR儀加熱至99 ℃處理10 min以滅活蛋白酶K，隨后冷卻至室溫或4℃。
4) 滅活完成的樣本加130 μL的ddH2O以稀釋DNA，隨后混勻，2000 rpm離心1 min將消化剩余的毛發(fā)、骨頭等固態(tài)雜質(zhì)離心于管底，后續(xù)PCR試驗(yàn)取上清作為模板。
5) 提取的DNA產(chǎn)物可短期保存于4 ℃，長(zhǎng)期保存可置于-20 ℃或更低溫度，避免反復(fù)凍融。DNA樣品的OD260/280在1.8-2.0之間。
注意：
① 需要充分裂解鼠尾，樣本應(yīng)消化至肉眼看不到顆粒為止。
② DNA模板濃度應(yīng)控制在50-100ng/μL進(jìn)行PCR。
03 | PCR擴(kuò)增
以某雙轉(zhuǎn)基因小鼠的基因鑒定方案為例，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，應(yīng)先確定PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。
注意：
設(shè)置對(duì)照Control非常重要，不僅可以幫我們快速鑒別基因型，還能驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系是否正常工作。建議在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置：陰性對(duì)照（不加模板的反應(yīng)，確保無(wú)污染產(chǎn)生假陽(yáng)性）；陽(yáng)性對(duì)照（含已知基因型的模板，確保引物和反應(yīng)體系有效）。
04 | 凝膠電泳
1）配置凝膠：根據(jù)目標(biāo)條帶配置1%-3%的瓊脂糖凝膠，將1g-3g瓊脂糖溶于100mL TAE緩沖液，微波爐加熱至瓊脂糖融化（1min），加入10μL核酸染料（EB替代物），倒入電泳模板中，隨后插入梳子，待冷凝后使用。
2）加樣：向瓊脂糖凝膠中加入適量的DNA，小孔建議加10μL，大孔建議加20μL，并根據(jù)目標(biāo)條帶大小選擇合適的DNA marker加入凝膠中。
3）跑膠：電泳儀設(shè)置100V-120V電壓，跑20-30min，以溴酚藍(lán)遷移至膠長(zhǎng)2/3處停止。
4）成像：使用凝膠成像系統(tǒng)觀察，拍攝照片。
5）結(jié)果讀?。焊鶕?jù)膠圖中DNA Marker比對(duì)目標(biāo)條帶大小，區(qū)分野生型、雜合子及純合子，出具基因型鑒定結(jié)果報(bào)告。
注意：
① PCR產(chǎn)物可根據(jù)條帶大小，選擇不同濃度的凝膠進(jìn)行電泳（200bp：3%；200-1,000bp：1.5%-2%；>1,000bp：1%），后續(xù)根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行基因型分析。
② 微波加熱時(shí)避免暴沸，冷卻至60°C再倒膠，減少氣泡和孔隙不均。
問(wèn)題三：
Q：鼠達(dá)人，PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性、或者是非特異性條帶，怎么解決呢？
A：這些情況在平常操作中，如果沒(méi)有加以注意，很容易出現(xiàn)，針對(duì)此，整理出了以下解決措施供參考。
01 | 假陰性問(wèn)題
①如果模板中存在微量抑制劑，可適當(dāng)稀釋DNA模板，降低雜質(zhì)比例；
②重新純化提取DNA模板（乙醇純化去除小分子抑制劑、離心柱純化去除蛋白質(zhì)/多糖等）；
③及時(shí)電泳，避免擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)時(shí)間存放室溫或4°C冰箱導(dǎo)致降解。
02 | 假陽(yáng)性問(wèn)題
① 如果是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)陽(yáng)性污染，如試劑耗材污染，建議更換試劑，滅菌耗材；如氣溶膠污染，建議UV照射操作環(huán)境。
② 如果不是污染造成的，建議重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)，條帶不小于500bp，避免靶序列或引物過(guò)短。
03 | 出現(xiàn)非特異性條帶
非特異性擴(kuò)增條帶較弱時(shí)：
① 降低引物和聚合酶的用量，或者更換酶。
② 提高退火溫度，或采用梯度PCR法來(lái)優(yōu)化條件。
③ 降低循環(huán)次數(shù)，避免引物過(guò)多的非特異性結(jié)合。
④ 純化模板或者稀釋模版，避免非特異性物質(zhì)或降解片段的干擾。
非特異性擴(kuò)增條帶較強(qiáng)（非特異性條帶的亮度與目的條帶幾乎相當(dāng)甚至更亮）時(shí)：
建議重新設(shè)計(jì)PCR引物或嘗試使用touchdown PCR。
本期分享就到這里，我們下期再見(jiàn)~
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